PBCV-1 DNA Ligase是一种ATP依赖的DNA连接酶，能够高效催化与一条互补的RNA单链配对的两条相邻DNA单链的连接反应。这两条相邻的DNA链中，提供3'羟基的被称之为受体DNA链(Acceptor DNA)，提供5'磷酸的被称之为供体DNA链(Donor DNA)；在这个连接过程中需要一条互补的RNA链对两条DNA单链起“夹板”或“支架”的作用。
PBCV-1 DNA Ligase在连接点处可以耐受多种碱基对的组合，但当5'端磷酸化的Donor DNA与“夹板”RNA所形成的第一个碱基对是dC/G和dG/C时会产生部分抑制，当Donor DNA预“夹板”RNA所形成的第1和第2个碱基对都是dC/G或dG/C碱基对时，酶活性会被更进一步被抑制。5'磷酸化的Donor DNA的第一个碱基为dA或dT时连接效率较高；3'端羟基化的Acceptor DNA的第一个碱基为dT时连接效率较高。
PBCV-1 DNA Ligase对于通过RNA“夹板”介导固定的DNA底物具有比T4 DNA ligase更强的亲和力(Km =~1nM），和随后的PCR、qPCR或滚环扩增等技术相结合，能够实现在复杂的混合物中超高灵敏度检测到低于纳摩尔级的特定目标RNA。PBCV-1 DNA Ligase的这种活性使得该酶可以用于包括各种SNP的miRNA、mRNA和非编码RNA的定性或定量检测，以及用于二代测序和分子诊断。
PBCV-1 DNA Ligase对ATP的浓度要求比较宽泛，ATP浓度为10μM～1mM时都可以有效发挥作用；对pH的耐受也比较高，在pH6.5-pH9的范围内都能很好发挥作用。通常，当Mg2+的浓度大于5mM、pH在7.5～8.0之间时，PBCV-1 DNA Ligase具有较高的活性。该酶的活性可以通过提高反应温度至37℃，补充5mM Mn2+而得以增强；但当反应体系中的盐离子浓度超过100mM时，该酶活性即被抑制。
我司的PBCV-1 DNA Ligase催化连接与互补RNA链退火的相邻DNA单链的效果参考图2。
图2．百奥莱博的PBCV-1 DNA Ligase与同类竞品催化连接与互补RNA链退火的相邻DNA单链的效果图。为了更直观的观察到PBCV-1 DNA Ligase的连接效果，本实验利用百奥莱博的热稳定RNase H(货号：YTB4029)催化降解连接产物中的互补RNA链，以便于电泳时可以清晰观察到连接的DNA (ligated DNA)的电泳效果。在20μL反应体系(50mM Tris-HCl pH7.5,10mM MgCl2,1mM ATP,10mM DTT)中，加入通过退火产生的2μM的RNA:DNA杂交链，以及图中指定量的本制品或N公司竞品的PBCV-1 DNA Ligase，25℃孵育15min进行连接反应，连接反应结束之后置于冰上3min，取出10μL反应液加入10U的热稳定RNase H(货号：YTB4029) 65℃孵育20min以终止连接反应并同时消化互补的RNA单链。取出5μL消化后的产物，加入1μL 6X DNA Loading Buffer，95℃变性5min，然后进行7M Urea+15%聚丙烯酰胺凝胶电泳。室温条件下用1X TBE作为电泳液，180V电泳75min；NadRed溶液(2000:1) (货号：YT015)室温染色15min，凝胶成像仪拍照观察。如图所示，本制品与N公司的产品相比，具有类似的催化与互补RNA链退火的相邻DNA单链进行连接的效果。
基于探针法的microRNA等小RNA的检测；通过互补RNA序列进行“夹板”固定的单链DNA的连接；使用DNA探针进行连接达到检测特定RNA的目的；SNP或可变剪接的检测；RASL-seq分析。
PBCV-1 DNA Ligase基因通过E.coli菌株表达纯化而获得。
One unit is defined as the amount of enzyme needed to ligate (to 50% completion) 2 picomoles of a tripartite FAM-labeled DNA:RNA hybrid substrate in a 20μL reaction at 25℃in 15minutes in 1X Ligation Buffer.
| 组分 | 1250U | 5kU | 25kU |
| PBCV-1 DNA Ligase(25U/μL) | 50μL | 200μL | 1mL |
| 10×Reaction Buffer | 150μL | 600μL | 2×1.5mL |
保存：-20℃
10mM Tris-HCl(pH7.4@25℃)，300mM NaCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，50% (v/v) Glycerol。
10×Reaction Buffer：
500mM Tris-HCl (pH7.5@25℃)，100mM MgCl2，10mM ATP，100mM DTT。
65℃加热20分钟。
不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。
- PBCV-1 DNA Ligase被一价阳离子所抑制，建议一些常见的盐如NaCl、KCl等在反应中应保持在50mM以下。为了保持该酶的贮存稳定性，酶被提供在含有300mM NaCl的储存缓冲液中。该酶被加入反应系统时，至少应该进行6倍的稀释，通常宜进行大于10倍的稀释。
- PBCV-1 DNA Ligase的反应温度建议在16～37℃之间进行初次实验，建议反应温度可设为25℃。该酶的连接反应时间通常可以在10～60min之间，对于很多实验来说，推荐的连接反应时间为15min。
- 在反应体系中PBCV-1 DNA Ligase的最终浓度建议在100nM～1μM之间。百奥莱博的PBCV-1 DNA Ligase的浓度约为13μM。建议在连接反应中将酶的浓度至少设为底物浓度的2～3倍。
- 如果反应不能像预期的那样有效进行，建议延长孵育时间而不是将反应中酶的浓度增加至超过1μM。
- 对于在标准PBCV-1 DNA Ligase反应缓冲液中连接效率低的底物，例如连接点处具有G:C碱基对的底物，建议将ATP的终浓度调整到10μM以提高连接效率。
- 提高反应温度可以提高PBCV-1 DNA Ligase的活性和连接专一性；37℃反应可提高microRNA等小RNA的检测效果。
- PBCV-1 DNA Ligase连接效率会随着“夹板”RNA长度的减少(50bp～20bp)而逐渐降低，当RNA“夹板”长度小于等于10nt时，连接效率基本为零。
- 杂合DNA/RNA双链底物的制备。
将两条单链DNA和一条与它们互补的单链RNA等摩尔数混合，推荐的终浓度为20μM，在10～50μM范围内均可，90℃孵育1min，然后通过梯度降温至25℃退火形成DNA/RNA杂合双链。推荐使用百奥莱博的5×RNA寡核苷酸退火缓冲液(货号：YT529)，并按照该产品使用说明进行退火反应，退火后的双链如果不立即使用，推荐在-80℃保存。 - 对于DNA/RNA杂合链中两条DNA链nick的连接，参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
成分 用量 终浓度 DEPC-treated Water 15μL - 10×Reaction buffer 2μL 1× Nicked DNA/RNA Substrate (1μM) 2μL 0.1μM PBCV-1 DNA Ligase (25U/μL) 1μL 1.25U/μL 总体积 20μL -
注：由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA的操作规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要确保是RNase-free的，或者是经过DEPC处理以去除RNase的。 - 连接：25℃孵育15～60min。
- 终止：65℃孵育20min；或加EDTA以灭活。
- 将反应后的样品放置于冰上以待短时间内使用或直接冻存于-20℃。
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